自噬与骨髓间充质干细胞放射损伤的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞在造血干细胞致死放射剂量下却能够存活，并且仍能维持典型的干细胞特性，促进放射后的造血恢复，而自噬是细胞在应激状态下重要的适应性调控机制，可能参与骨髓间充质干细胞的放射耐受。
目的：探索放射诱导的自噬与人骨髓间充质干细胞在放射损伤过程中的关系。
方法：取体外培养的处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，随机分为对照组、3-甲基腺嘌呤组、雷帕霉素组、照射组、照射联合3-甲基腺嘌呤组和照射联合雷帕霉素组，3-甲基腺嘌呤组和雷帕霉素组细胞分别使用5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和200 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素干预12 h，照射组细胞接受单剂量 6 Gy X射线照射2 h，照射联合3-甲基腺嘌呤组和照射联合雷帕霉素组分别在接受相应药物干预12 h后，接受6 Gy X射线照射2 h。
结果与结论：对照组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞所占比例均较低；照射组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞比例较对照组均明显升高，且可见较高比例的自噬+凋亡细胞；应用3-甲基腺嘌呤后，自噬泡阳性细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高，但自噬+凋亡细胞比例与照射组相比无显著差异；而给予雷帕霉素后发现自噬泡阳性细胞显著高于照射组，但凋亡细胞比例与照射组相比无明显差异，并且未观察到自噬+凋亡细胞。对照组与3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平均很低；雷帕霉素组与照射组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平较对照组均明显升高，但照射组低于雷帕霉素组；照射联合3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达明显低于照射组，但仍高于对照组，照射联合雷帕霉素组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达较照射组和雷帕霉素处理组均明显升高。提示自噬可能对骨髓间充质干细胞具有放射保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 自噬, 骨髓间充质干细胞, 放射, 微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ, 3-甲基腺嘌呤, 雷帕霉素

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells can survive under the lethal dose of radiation in response to hematopoietic stem cells, and still maintain the typical characteristics of stem cells to promote hematopoietic recovery after radiation. However, autophagy is an important mechanism for cellular adaptation under stress, which may be involved in radiation tolerance of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the role of autophagy in human bone marrow mesenchymal stem cells in response to irradiation.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro at logarithmic phase were collected and randomized into control, 3-mehyladenine, rapamycin, irradiation, irradiation+3-mehyladenine and irradiation+rapamycin groups. The autophagy reactions of bone marrow mesenchymal stem cells were regulated by 5 mmol/L 3-mehyladenine and 200 nmol/L rapamycin for 12 hours in the 3-mehyladenine and rapamycin groups, respectively. Two-hour 6 Gy X-ray irradiation was performed in the irradiation group and two complication groups undergoing 12-hour corresponding drug intervention.
RESULTS AND CONCLUSION: The proportions of cells with autophagic vacuoles and apoptotic cells were higher in the irradiation group than the control group, moreover, autophagic+apoptotic cells were increased in the irradiation group. 3-mehyladenine intervention could decrease the proportion of cells with autophagic vacuoles, and increase the number of apoptotic cells. But there was no difference in the proportion of autophagic+apoptotic cells between the 3-mehyladenine and irradiation groups. After rapamycin intervention, the proportion of autophagic cells was higher than that in the irradiation group, but no difference in the proportion of apoptotic cells between the two grups, as well as there were no autophagic+apoptotic cells. The expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3-II was ranked as follows: the control and 3-mehyladenine groups < irradiation+3-mehyladenine group < irradiation group < rapamycin group < irradiation+rapamycin group. These findings indicate that autophagy induced by irradiation could contribute to protecting bone marrow mesenchymal stem cells from irradiation injury.

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Key words: autophagy, radiation injuries, mesenchymal stem cells, radiotherapy, cytoskeleton

中图分类号:

R394.2

陈哲，刘洁，张斌. 自噬与骨髓间充质干细胞放射损伤的关系[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4474-4478.

Chen Zhe, Liu Jie, Zhang Bin. Role of autophagy in human mesenchymal stem cells in response to irradiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4474-4478.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞形态及鉴定体外培养的第3代骨髓间充质干细胞贴壁生长良好，显示典型长梭形外观(图1)。流式细胞仪检测结果显示骨髓间充质干细胞 CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，而CD44、CD71表达阳性。

2.2 放射损伤及自噬干预对骨髓间充质干细胞超微结构的影响通过透射电镜可以观察到自噬泡阳性细胞、凋亡细胞以及同时具有自噬泡和凋亡特点的细胞(图2)。自噬泡阳性细胞的胞质中可见圆形或椭圆形、大小不一的自噬泡，其内容物多为膜性结构，也可见线粒体及液性成分。凋亡细胞则体积变小，胞质浓缩，核染色质凝集、边移，核膜、质膜及细胞器结构基本完好，并可见凋亡小体，符合凋亡的基本形态特点。各组中上述3种细胞所占的比例不同(表1)。

对照组及3-甲基腺嘌呤组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞所占比例均较低，且两者差异无显著性意义(P > 0.05)；雷帕霉素组中自噬泡阳性细胞比例与对照组相比明显增高(P < 0.05)，仅次于照射联合雷帕霉素组，而凋亡细胞所占比例较低，但与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；以上3组中均未见自噬+凋亡细胞；照射组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞比例较对照组均明显升高(P < 0.05)，且存在较高比例的自噬+凋亡细胞，但自噬泡阳性细胞比例低于雷帕霉素组(P < 0.05)；照射联合3-甲基腺嘌呤组中自噬泡阳性细胞比例较照射组明显下降(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.05)，凋亡细胞比例较照射组明显升高(P < 0.05)，自噬+凋亡细胞比例与照射组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；照射联合雷帕霉素组中自噬泡阳性细胞比例高于照射组(P < 0.05)，且为各组中最高，而凋亡细胞比例与照射组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，但未见自噬+凋亡细胞。

2.3 放射损伤及自噬干预对骨髓间充质干细胞中微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ表达的影响 Western blot检测显示，对照组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平很低，3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，雷帕霉素组与照射组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达水平较对照组均明显升高(P < 0.05)，但照射组低于雷帕霉素组(P < 0.05)，照射联合3-甲基腺嘌呤组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达明显低于照射组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.05)，照射联合雷帕霉素组微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白表达较照射组和雷帕霉素处理组均明显升高(P < 0.05)，为各实验组中最高值(图3，表2)。

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引言

材料方法

设计：体外细胞学实验。

时间及地点：实验于2014年1月8日在河北北方学院完成。

材料：实验骨髓标本来自经血常规及骨髓涂片检测无血液系统疾病的健康供者，实验前供者对本实验目的、过程均知情，并同意自愿捐献骨髓。

方法：

骨髓间充质干细胞的培养及鉴定：无菌条件下取正常供者骨髓5 mL，以肝素抗凝，用L-DMEM培养液倍比稀释,缓慢加至等量Ficoll分离液上，室温下1 500 r/min离心 20 min，吸取界面乳白色单个核细胞层，用L-DMEM培养液洗涤2次，然后重悬于L-DMEM培养液中并计数，以2× 10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，每3 d换液1次并去除未贴壁细胞，当细胞达80%-90%融合后，以1∶2的比例传代培养，传至第3代时，应用流式细胞仪进行骨髓间充质干细胞表面标记鉴定并用于实验^[13]。

细胞分组：取体外培养的处于对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，随机分为6组。

透射电镜观察细胞超微结构：各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心5 min，得到的细胞团块用体积分数2.5%戊二醛及体积分数1%饿酸双重固定2 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，通过透射电镜观察、摄片。并在电镜下随机计数30个非坏死细胞，计算凋亡细胞和自噬泡阳性细胞所占的比例。

Western blot检测细胞中微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ的表达：收集各实验组细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入蛋白提取裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃下15 000×g离心30 min，吸取上清，应用BCA法检测蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS聚丙烯凝胶电泳，之后电转膜至 PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，加入兔抗人微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ单克隆抗体、β-actin多克隆抗体4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，ECL发光，暗室内曝光、显影、定影、观察实验结果。使用Image J软件分析各条带积分吸光度值，根据微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/β-actin积分吸光度比值计算微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

主要观察指标：细胞的超微结构及细胞内微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ的表达情况。

统计学分析：所有实验数据以x(_)±s表示，运用SPSS 13.0统计软件(美国SPSS公司)进行单因素方差分析，组间两两比较选用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨髓是放射敏感组织，即使较低剂量的放射暴露也会引起骨髓抑制。目前异基因造血干细胞移植仍然是治疗放射后造血衰竭的有效手段。然而有研究发现供者造血干细胞植入后的造血恢复和重建主要依赖于受者放射后残存的骨髓间充质干细胞^[6]。并且也有报道显示长时间异基因干细胞移植后的间充质干细胞仍然源于受者^[14-15]。这表明骨髓间充质干细胞能够耐受放射损伤，而且其放射抗性对放射后的造血恢复意义重大，因此在移植前预处理和放射治疗中如何最大限度地保证骨髓间充质干细胞的数量和质量是临床亟待解决的问题，这还需从骨髓间充质干细胞放射耐受的机制入手。自噬是真核细胞在应激状态下通过溶酶体降解-再循环途径降解细胞内受损或老化的细胞器、大分子等保证细胞基本物质能量代谢的适应性调控机制^[8,16]。许多研究发现某些肿瘤细胞在放射应激下能够激活自噬反应，抵抗放射损伤^[9-10,17-19]。但是自噬是否与骨髓间充质干细胞的放射抗性有关，目前还鲜有报道。自噬典型的形态学特征是胞浆内出现包裹有待降解物的单层或双层膜泡状结构，即自噬泡或自噬体的形成^[20]。透射电镜下观察自噬形态学变化是检测自噬的金标准^[21]。而微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白定位于前自噬体和自噬体膜上，是目前惟一可靠的与完整自噬体相关的标志分子^[22-24]。

实验首先通过透射电镜观察到了3种超微结构特点不同的非坏死细胞，即胞浆中有大量自噬泡聚集的自噬泡阳性细胞、具有典型凋亡特征的凋亡细胞和兼具两者特点的自噬+凋亡细胞。其中只有照射组和照射联合3-甲基腺嘌呤组具有自噬+凋亡细胞。而对照组中自噬泡阳性细胞及凋亡细胞所占比例均较低。本实验所应用的自噬抑制剂和激活剂的浓度为调节自噬反应常用的浓度，观察发现对正常骨髓间充质干细胞的凋亡无显著影响。给予6 GyX射线照射骨髓间充质干细胞2 h后观察发现其自噬泡阳性细胞及凋亡细胞比例较对照组均明显升高，且可见较高比例的自噬+凋亡细胞。应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤后，自噬泡阳性细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高，但自噬+凋亡细胞比例与照射组相比无显著差异。而给予自噬激活剂雷帕霉素后发现自噬泡阳性细胞显著高于照射组，但凋亡细胞比例与照射组相比无明显差异，并且未观察到自噬+凋亡细胞。其次实验检测了细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ蛋白的表达水平，进一步反映各组细胞的自噬反应水平，结果与形态学观察相一致。以上结果表明，放射损伤可以诱导骨髓间充质干细胞发生自噬和凋亡，并且在同一细胞中可以同时观察到胞浆中自噬泡的积聚和胞核中染色质的浓缩边集。自噬和凋亡都是细胞对损伤剌激的适应反应。目前越来越多研究显示两者在功能及分子信号调节机制上存在交织联系，在一定条件下可以相互协同或拮抗，甚至在同一细胞中可先后发生或同时存在^[25-28]。有研究发现帕金森疾病的塞梅林氏神经节细胞超微结构就同时具有自噬和凋亡的特征^[29]，与本次实验的结果相似。而且有研究者认为自噬是凋亡的先导者，甚至是启动者，即当细胞受到损伤刺激后自噬首先作为促存活机制“自救”，但当损伤超过了自噬的处理能力，则会激活凋亡，发生不可逆的程序性死亡^[25]。实验结果显示抑制放射诱导的自噬后，骨髓间充质干细胞凋亡明显增加，增强放射诱导的自噬后，尽管凋亡比例未下降，但是自噬向凋亡的转化被拮抗，实质上仍然减低了凋亡率，由此可见自噬可能对骨髓间充质干细胞具有放射保护作用。

目前认为放射后DNA损伤反应的快速启动及相应损伤修复基因如增殖细胞核抗原、毛细血管扩张性共济失调突变基因、细胞周期检测点激酶2等的上调、信号传导通路的激活与骨髓间充质干细胞的放射耐受密切相关^[5^，^30]。基于对自噬与骨髓间充质干细胞放射损伤的关系仅做了初步的研究，还有许多不足之处，因此自噬对骨髓间充质干细胞的放射保护作用及其机制仍需进一步深入研究，尽早为临床放射治疗中骨髓间充质干细胞的放射防护提供有效的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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